染料法原理巧妙之處在染料法中，經典染料如Sybr Green，會與DNA雙鏈中的小溝非特異結合，隨著擴增量增多，其熒光強度會等比例加劇。問題來了，整個過程中，雖然雙鏈DNA數量以指數級增長，可熒光染料并沒有增加，但熒光強度為什么會升高呢？我們可能知道，其關鍵在于游離的染料幾乎只能發出微弱的熒光，只有結合小溝時，它們熒光強度會瞬間增強成百上千倍，這又是什么原因。當SYBR Green I 染料在溶液中自由漂浮時，它的化學鍵可以自由旋轉、振動，整個分子也在不停地布朗運動。它吸收一個光子能量后，會從基態躍遷到激發態，這個激發態的能量需要以某種方式釋放出來，分子才能回到基態。在游離狀態下，激發態能量很容易通過分子自身的旋轉、振動（即分子內運動）轉化為熱能并耗散掉，這個過程被稱為 “非輻射衰變”。因為能量主要通過非輻射衰變（發熱）消耗了，所以通過發射光子（即熒光）這種“輻射衰變”途徑釋放的能量就非常少，熒光信號極其微弱。當SYBR Green I 染料插入到雙鏈DNA的小溝中時，它被緊緊地固定在了DNA雙螺旋結構里，就像三明治的夾心一樣，這種結合極大地限制了染料分子的自由旋轉和振動。此時，當染料吸收光子能量變為激發態后，由于分子運動被嚴重限制，“非輻射衰變”這個能量釋放通道就被大大削弱了，甚至幾乎被關閉了，最后只能以更高的 “輻射衰變”途徑釋放，即發射出一個熒光光子，因此，我們檢測到的熒光信號就變得非常強。
